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石蜡包埋组织样本核酸提取:现状与难点分析
2023-07-28



近年来,随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标记物的出现,分子病理学技术迅速从科研发展到常规的病理诊断,以石蜡组织切片为材料进行分子水平的基因检测和筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手段。石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,简称FFPE)组织是临床病理诊断中使用最广、最常见的样本保存类型之一。


FFPE是一种常用的样本处理技术,其通过将组织样本浸泡在福尔马林中固定,然后将其包埋在石蜡中来进行样本的保护和储存。FFPE样本具有可常温保存、保存时间长、样本可及性强、运输方便、可关联临床及多组学数据等优点。在大量的临床研究中,尤其是对于病程长、预后不确定的疾病,如肿瘤,往往会使用FFPE样本进行验证,或开展回顾性研究。



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(图片来源于网络,如有侵权请联系删除)


自1985年Goelz等首次成功地从FFPE组织中提取出了DNA之后,国内外许多学者开展了对FFPE组织核酸提取方法的研究。但组织经过福尔马林固定、石蜡包埋后很容易引起核酸的降解和组蛋白交联,给下游的PCR及高通量测序带来了很大挑战。因此如何从中获得较高纯度和质量的核酸成为后续临床诊断及相关研究的关键前提。




常规FFPE样本

核酸提取流程



1

样本切片

FFPE样本在提取前需要进行切片处理,一般需要5-6个切片,一片镜检确定肿瘤细胞含量,其他进行后续提取处理。切片的薄厚程度对后续观察和提取会有一定影响。切片过厚不利于后续染色和组织学观察,而且组织脱蜡和蛋白酶消化困难增加;切片过薄易造成DNA的机械损伤,同时切片总面积的增加,其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多。

2

样本脱蜡

为消除石蜡对核酸提取和PCR扩增的不良影响,必须在保证不增加外源性PCR抑制因子和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底的脱蜡。在此过程中,先溶解石蜡,然后去除暴露样品,用于后续裂解缓冲液和蛋白酶K的处理。多种溶剂适用于脱蜡,如二甲苯、庚烷和柠檬烯等。作为溶剂法的替代,石蜡也可通过加热与FFPE样品分离。

3

蛋白酶K消化

为了将DNA与结合的蛋白质分离,FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶,这个步骤还可防止DNA发生降解。注意要把握好消化时间,可以根据组织类型、组织大小进行调节,使DNA充分释放。

4

基因组DNA纯化

FFPE样本中核酸和蛋白质是紧密交联在一起的,进行组织消化后样品已经变成水化状态,此时需要进行震荡断裂交联,释放DNA用于后续纯化。如果可能的话,因交联而引起的化学修饰也应当逆转,因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收,而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物,在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心,因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化。

5

核酸提取

根据不同的研究目的选取相应的方法提取DNA,常用的有酚氯/仿抽提法、柱膜法、磁珠法等。




FFPE样本

酸提取难点



01

耗时长目前石蜡切片样本的核酸提

取方法及试剂盒绝大部分还是以手工

操作为主,多数均需要经过脱蜡、裂

解液、结合、洗涤、洗脱等步骤,整

个操作流程比较繁琐且耗时在4个小

时以上。

02

重复性低FFPE技术无法控制不同

样本的处理过程对样本的影响,这可

能导致样本间差异性大,会影响结果

的可靠性和数据分析的结果。

03

脱蜡效率低目前常规的提取方法大

多使用有机溶剂进行脱蜡,如二甲苯

等,但使用二甲苯脱蜡不仅影响组织

切片质量,容易造成核酸片段化和得

率低,而且对人体有毒副作用,危害

实验员健康,同时切片越厚或存放时

间越长,脱蜡效果越差。

04

分离难度大福尔马林固定导致核酸

之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间

的交联。固定时间越长,交联程度越

高,纯化难度越大。样本细胞形态和

蛋白质结构可能会发生改变从而可能

会影响病理诊断和分子生物学研究的

结果和准确性。

所以,针对FFPE样本中的核酸提取需要更加快速有效的方法。



参考文献:

[1]一种福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法,复旦大学附属中山医院2021年12月.



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